理解上的飞跃

一篇论文发表在美国国家科学院院刊该论文由加州大学圣巴巴拉分校机械工程教授、校园生物工程研究所所长贝丝·普鲁特(Beth Pruitt)合著，描述了包括斯坦福大学、华盛顿大学和肯塔基大学研究人员在内的一项复杂的长期合作的结果。这项研究使人们对基因突变如何在细胞水平上引起HCM有了新的认识，并对如何预防HCM有了新的看法。

在他们的论文中，作者解释说，已经确定了1000多个导致HCM的基因突变。它们中的大多数存在于编码肌肉蛋白的基因中，肌肉蛋白是心肌结构的组成部分，负责产生和调节收缩和舒张。大约三分之一的突变位于β心肌肌球蛋白，这是驱动心脏细胞收缩的主要蛋白质。心肌和我们身体其他肌肉的收缩，是由运动蛋白肌球蛋白沿着肌动蛋白分子链“行走”的过程造成的，这个过程被称为肌动蛋白横桥循环。在这个过程中，以ATP形式存在的化学能转化为机械能，最终导致心脏收缩。

在收缩之前，一个缠绕在一起的两股肌球蛋白分子的一条链的头部被一个肌动蛋白分子所包围。当被称为生物系统“能量货币”的ATP分子与肌凝蛋白头结合时，肌肉收缩就开始了。肌凝蛋白头和附着的ATP从肌动蛋白上分离，ATP开始水解，转化为ADP和磷酸基。这一过程释放的能量将肌凝蛋白“公鸡”到高能量状态，并改变肌凝蛋白的形状，使其准备沿着肌动蛋白爬行。此时，磷酸从肌凝蛋白中释放出来，导致肌凝蛋白推动肌动蛋白并释放磷酸，这导致肌凝蛋白走到下一个肌动蛋白链并收缩肌肉。所有这一切，包括数百万个肌凝蛋白头以几微秒的速度穿过肌动蛋白，必须以适当的速度发生，以保持心脏健康。

由于HCM经常在β心肌肌球蛋白蛋白突变的患者中观察到，因此有人假设HCM突变会导致一系列事件，最终表现为心脏本身的损害。这项研究对这一想法进行了测试，重点放在一个单一的突变P710R上，与其他MYH7突变相比，P710R显著降低了体外运动速度——肌凝蛋白马达在肌动蛋白上行走的速度——这导致了运动速度的增加。

这个项目的首要研究问题是了解与心脏病相关的突变如何在细胞水平上改变心脏功能。

该团队使用CRISPR技术，通过插入P710R突变，编辑人类诱导的多能性衍生干细胞心肌细胞(负责心脏收缩的细胞)。普鲁特领导着UCSB的干细胞库，在那里，没有遗传异常的“干净”细胞系被维持和繁殖，供大学研究人员使用。这种干净、无突变的细胞系为与细胞进行比较提供了一个完美的基准，可以非常精确地看到P710R突变的影响。例如，该研究小组目前正在测试同一遗传背景下与心脏病相关的不同突变的影响。

“你可以有10个人在这种蛋白质上有相同的基因突变，他们可能有不同程度的临床意义，因为他们的其余基因组是不同的;这就是让我们成为独立个体的原因。”“这些线条让我们可以检查基因突变的结果。通过比较不同突变的影响，我们可以开始梳理这些变化是如何导致HCM的。它使我们能够仔细观察细胞如何以及为什么以这种方式适应突变，并获得数据，并将其与心壁的厚度和下游发生的所有其他事情联系起来。”

这项研究开始于近15年前，当时普鲁伊特还在斯坦福大学，并促成了这篇合作论文。现在，CRISPR技术使研究人员能够设计表达与心脏疾病相关的特定突变的细胞，然后评估分子和功能变化，以确定在HCM患者中发现的个体突变对细胞的影响。这些研究将为分子水平的个体突变如何在患者中转化为HCM提供一个机制上的理解。

在这个项目中，一旦引入突变，Pruitt实验室(UCSB)和Bernstein实验室(斯坦福大学)合作对细胞进行分析，使用牵引力显微镜，一种允许同时观察跳动细胞及其产生的力的分析。斯坦福大学的Spudich实验室在分子水平上使用光学陷阱对同一突变蛋白进行了单独的研究，其中施加光压力来精确控制肌凝蛋白头部沿着肌动蛋白行走时珠之间的肌动蛋白“哑铃”的位置和力量，以测量肌凝蛋白的能量循环。该实验显示，P710R突变减少了肌凝蛋白马达的步长(即每一步的长度)和肌凝蛋白从肌动蛋白分离的速率。

在与肯塔基大学研究员肯尼斯·坎贝尔的合作中，这些观察结果与肌凝蛋白马达如何在细胞中相互作用以产生力量的计算模型进行了比较。研究结果证实了肌凝蛋白“超放松状态”调节的关键作用。正如Pruitt解释的那样，“肌球蛋白头部大部分时间都处于超级放松的状态，指的是它与肌动蛋白分离的状态。任何改变肌凝蛋白马达与肌动蛋白结合的时间或强度的突变或药物都会改变细胞力的产生，并改变驱动重塑、生长或肥大的下游信号事件。”

本研究发现P710R突变使超松弛状态不稳定。结果，更多的肌凝蛋白头与含有突变的细胞中的肌动蛋白结合，这就解释了在这些细胞中观察到的力量的增加。

对于普鲁特来说，除了重要的科学发现之外，这项工作的一个关键收获是持续合作的价值。她说:“这篇论文所涵盖的天平通常不是任何一个实验室甚至任何两个实验室的研究课题。”“这就是为什么这篇论文有这么多作者，包括和我一起工作的几名学生和博士后，詹姆斯·斯普迪奇和丹尼尔·伯恩斯坦。

“这在科学上意义重大，但也令人满意，因为这种程度的集成使得在多个尺度上测试这一想法成为可能。在这些实验室和这些技能之间进行如此广泛的多学科合作是很有趣的，看到分子测量和计算的力量，以及细胞衍生的测量，使我们能够进行基因工程并解剖出单个突变。”普鲁特说道。“直接测试一个特定的突变是如何引入导致HCM的变化的，这真的是非常惊人的。”

作为这次合作的结果，Pruitt补充说:“我们可以了解细胞水平上发生了什么。然后我们可以开始开发模型，并确定下一代药物疗法。我们不仅可以识别症状，还可以研究导致功能障碍的机制，然后在它转变为疾病之前在细胞水平上解决这些问题。”