纳米技术使RNA结构在接近原子分辨率的可视化

我们生活在一个由RNA构成和运行的世界，RNA是遗传分子DNA同样重要的兄弟。事实上，进化生物学家假设，在DNA和由其编码的蛋白质出现之前，RNA就已经存在并自我复制了。快进到现代人类:科学表明，只有不到3%的人类基因组被转录成信使RNA (mRNA)分子，而mRNA分子又被翻译成蛋白质。相比之下，82%的基因被转录成具有其他功能的RNA分子，其中许多功能仍然是谜。

为了了解单个RNA分子的作用，需要在其组成原子和分子键的水平上破译其3D结构。研究人员通过将DNA和蛋白质分子转变成可以用x射线束(x射线晶体学)或无线电波(核磁共振)检查的有序排列的晶体来进行常规研究。然而，这些技术不能以几乎相同的效果应用于RNA分子，因为它们的分子组成和结构灵活性使它们不容易形成晶体。

现在，由哈佛大学Wyss生物工程研究所的Wyss Core教员彭银博士和哈佛医学院(HMS)的Maofu Liao博士领导的一项研究合作，报告了一种用于RNA分子结构研究的全新方法。ROCK使用RNA纳米技术将多个相同的RNA分子组装成一个高度有组织的结构，这大大降低了单个RNA分子的灵活性，并增加了它们的分子量。将其应用于具有不同大小和功能的知名模型RNA作为基准，研究小组表明，他们的方法能够使用一种称为冷冻电子显微镜(cryo-EM)的技术对所含RNA亚基进行结构分析。他们的进展已被报道自然方法．

“ROCK正在打破目前RNA结构研究的限制，使RNA分子的3D结构能够以接近原子的分辨率解锁，这是现有方法难以或不可能获得的，”Yin说，他和Liao一起领导了这项研究。“我们希望这一进展能够激发许多基础研究和药物开发领域的活力，包括新兴的RNA治疗领域。”Yin也是Wyss研究所分子机器人计划的领导者，也是HMS系统生物学系的教授。

控制RNA

Yin在Wyss研究所的团队开创了多种方法，使DNA和RNA分子能够根据不同的原理和要求自组装成大型结构，包括DNA砖和DNA折纸．他们假设，这种策略也可以用来将自然产生的RNA分子组装成高度有序的环状复合物，通过特异性地将它们连接在一起，它们的自由弯曲和移动受到高度限制。许多rna以复杂但可预测的方式折叠，小片段彼此碱基配对。结果往往是一个稳定的“核心”和“茎环”向外围膨胀。

“在我们的方法中，我们安装了‘亲吻环’，连接属于相同RNA的两个拷贝的不同外围茎环，以一种允许形成整体稳定环的方式，包含感兴趣的RNA的多个拷贝，”迪刘博士说，他是尹小组的两位第一作者之一和博士后研究员。“我们推测，这些高阶环可以通过冷冻电镜(cryo-EM)进行高分辨率分析，冷冻电镜已首次成功应用于RNA分子。”

成像稳定RNA

在低温电子显微镜中，许多单个粒子在低温下被快速冷冻，以防止任何进一步的运动，然后在电子显微镜和计算算法的帮助下可视化，比较粒子的二维表面投影的各个方面，并重建其三维结构。彭和刘与廖和他以前的研究生弗朗索瓦·萨姆斯洛特博士合作，他是该研究的另一位共同第一作者。廖和他的团队在快速发展的低温电镜领域以及由特定蛋白质形成的单颗粒的实验和计算分析方面做出了重要贡献。

Cryo-EM在观察包括蛋白质、dna和RNA在内的生物分子的高分辨率细节方面比传统方法有很大的优势，但大多数RNA的小尺寸和移动趋势阻碍了RNA结构的成功测定。我们组装RNA多聚体的新方法同时解决了这两个问题，通过增加RNA的大小和减少其运动，”廖说，他也是HMS细胞生物学副教授。“我们的方法为通过冷冻电镜快速确定许多rna的结构打开了大门。”RNA纳米技术和冷冻电镜方法的整合使该团队将他们的方法命名为“通过安装接吻环使RNA寡聚化的冷冻电镜”(ROCK)。

为了提供ROCK的原理证明，该团队专注于来自四膜虫一种单细胞生物，和一个小的内含子RNAAzoarcus一种固氮细菌，以及所谓的FMN核糖开关。内含子RNA是分散在新转录RNA序列中的非编码RNA序列，必须“剪接”才能生成成熟RNA。FMN核开关存在于细菌rna中，参与维生素B2衍生的黄素代谢物的生物合成。在与其中一种黄素单核苷酸(FMN)结合后，它会改变其3D构象并抑制其母RNA的合成。

“大会四膜虫I组内含子形成环状结构，使样品更加均匀，并使计算工具能够利用组装结构的对称性。虽然我们的数据集规模相对较小，但ROCK的先天优势使我们能够以前所未有的分辨率解决结构问题。”“RNA的核心分辨率为2.85 Å [1 Ångström是100亿米，是结构生物学家使用的首选度量单位]，揭示了核苷酸碱基和糖骨架的详细特征。我认为，如果没有ROCK，我们不可能做到这一点，或者至少如果没有更多的资源，我们不可能做到这一点。”

Cryo-EM也能够捕捉到不同状态的分子，例如，如果它们改变了它们的3D构象作为它们功能的一部分。将ROCK应用于Azoarcus内含子RNA和FMN核开关，研究小组成功地确定了不同的构象Azoarcus内含子在其自剪接过程中跃迁，并揭示FMN核开关配体结合位点的相对构象刚性。

“彭银和他的合作者的这项研究优雅地展示了RNA纳米技术如何作为推动其他学科发展的加速器。能够可视化和理解许多自然发生的RNA分子的结构可能对我们理解不同细胞类型、组织和生物体的许多生物和病理过程产生巨大影响，甚至可以实现新的药物开发方法，”Wyss创始董事、医学博士唐纳德·英格伯(Donald Ingber)说Judah Folkman血管生物学教授他是哈佛医学院和波士顿儿童医院的教授，也是哈佛约翰保尔森工程与应用科学学院的生物工程教授。

这项研究也是由芝加哥大学教授、RNA化学和生物化学专家Joseph Piccirilli博士撰写的。该研究由美国国家科学基金会(NSF;拨款# CMMI-1333215, CCMI-1344915和CBET-1729397)，空军科学研究办公室(AFOSR);grant MURI FATE， #FA9550-15-1-0514)，美国国立卫生研究院(NIH;批准号5DP1GM133052, R01GM122797和R01GM102489)，以及Wyss研究所的分子机器人计划。