科学家使用化学修饰的引导rna，利用CRISPR-Cas13促进人类细胞中的基因敲除

今天发表在细胞化学生物学，该团队探索了一系列不同的RNA修饰，并详细介绍了修饰过的导则如何将CRISPR活性的效率从未修饰的导则的2倍提高到5倍。他们还表明，优化的化学修饰将CRISPR的靶向活性从48小时延长到4天。研究人员与Synthego公司和新英格兰生物实验室的科学家合作，汇集了一个在酶纯化和RNA化学方面具有专业知识的多样化团队。为了应用这些优化的化学修饰，研究团队针对来自健康捐赠者的人类T细胞中的细胞表面受体，以及导致COVID-19大流行的RNA病毒SARS-COV-2的所有已知变体所共有的基因序列的“通用”片段。

提高CRISPR-Cas13指南的效率和“寿命”对研究人员和药物开发人员具有至关重要的价值，可以更好地敲除基因，并有更多时间研究基因如何在相关途径中影响其他基因。

“CRISPR RNA引导物的递送可能具有挑战性，由于引导物的快速降解，敲除时间有限。我们受到了为其他dna靶向crispr开发的指导修改的启发，并希望测试化学修改的指导是否可以改善人类细胞中rna靶向CRISPR-Cas13的敲除时间，”Alejandro Méndez-Mancilla博士说，他是实验室的博士后科学家，也是该研究的共同第一作者。

根据实验室之前的研究，概述了最佳Cas13导向设计的原则，发表在自然生物技术2020年3月，研究人员系统地应用和测试了各种化学改性。例如，他们发现，在人类细胞系中添加3个具有不同类型化学键的碱基(磷酸修饰)将它们彼此连接起来，将RNA靶标敲除能力延长了几天。在原代T细胞中，磷酸化修饰导致CD46(一种参与免疫系统调节的受体)表达降低60 - 65%，而使用未修饰的引导物时则达到40 - 45%。

研究小组还发现，某些甲基化和倒置终止子修饰也提高了Cas13的活性。对于所有的修饰，这些修饰RNA碱基的位置也是至关重要的。如果放置不当，这些修饰会导致引导rna不起作用。“我们希望这些经过修改的CRISPR Cas13指南提高的有效性和稳定性将有助于为在原体细胞中使用rna靶向CRISPR铺平道路，”该实验室的博士后科学家Hans-Hermann Wessels博士说，他是该研究的共同第一作者。

“这些修改后的指南进一步扩大了基因组和转录组工程的工具箱。对于人类基因组中的非编码元素，靶向DNA可能是无效的，而其他生物，如冠状病毒或流感等RNA病毒，根本无法靶向，”Sanjana博士说，他是NYGC的核心教员，纽约大学生物学助理教授，纽约大学格罗斯曼医学院神经科学和生理学助理教授，该研究的高级作者。

例如，该团队在人类细胞中敲除RNA病毒SARS-CoV-2的通用前导序列片段的测试，只能使用Cas13等靶向RNA的CRISPR。SARS-CoV-2进入细胞并释放其RNA基因组，然后转录成更小的RNA，称为亚基因组RNA。这些亚基因组rna负责制造病毒复制所需的不同蛋白质，然后感染其他细胞。通用前导序列位于每个亚基因组RNA的开头。因此，一种针对通用前导序列的有效方法可能会保护细胞免受进一步的病毒复制和感染。

同样重要的是，CRISPR-Cas13能够在不永久改变潜在DNA基因组序列的情况下调节基因表达，就像Cas9或Cas12a等靶向DNA的crispr一样。“瞬时调节刺激基因表达结果通常是生物医学研究和药物开发的首选。例如，用于SARS-CoV-2的信使RNA疫苗短暂表达，但会产生一种持续超过其表达生命期的免疫记忆，”Sanjana博士指出。

研究报告的共同作者细胞化学生物学研究人员包括实验室博士后科学家Mateusz Legut博士;Anastasia Kadina，博士，Synthego公司化学研究高级科学家;Megumu Mabuchi，副科学家，RNA生物学和基因组编辑，新英格兰生物实验室;John Walker，博士，Synthego公司化学研究总监;G. Brett Robb博士，RNA与基因组编辑科学总监，Kevin Holden博士，Synthego公司科学主管。